صفحه شروعكتابكامپيوترپايان نامهطرح هالينك هاي مفيدسرگرميدرباره ما

ترجمه ، تاليف ، مقاله ، پروپوزال ، پايان نامه ، آمار ، گرافيك


ایمونودیفوزیون شعاعی منفرد

(SRID), Single Radial Immunodiffusion

این روش بر مکانیسم ساده ای استوار است و با توجه به نیاز محقق می تواند برای جستجو و عیار سنجی آنتی ژن یا آنتی بادی به کار برده شود.

پیش شرط ها:

الف - آنتی ژن باید محلول باشد. (ذره ای {Partlcle} نباشد و هاپتن هم نباشد)

ب - آنتی بادی باید پلی کلونال باشد. (مونوکلونال نباشد)

1 - جستجو و عیارسنجی آنتی بادی: خواسته محقق در این حالت بدست آوردن عیار آنتی بادی اختصاصی آنتی ژن در نمونه سرم مجهول است برای تعیین عیار از مقایسه با آنتی بادی دارای غلظت مشخص استفاده می شود و به کار بردن آنتی ژن معلوم برای پی بردن به حضور آنتی بادی اختصاصی آن، الزامی است.
آنتی ژن در داخل محیطی ژل مانند (نیمه جامد) از جنس آگارُز با غلظت معین و به ضخامت معین، به صورت یکنواخت قبل از انجماد ژل مخلوط می شود پس از انجماد ژل با استفاده از پانچ، چاهکی به قطر 3 میلی متر و عمق 2 میلی متر در داخل لایه آگارز ایجاد می شود و نمونه سرم مجهول (حاوی آنتی بادی) به مقدار معین در داخل چاهک ریخته می شود مدت زمان معینی در محفظه ای که دارای رطوبت کافی است نگهداری می شود. در این فاصله زمانی سرم با انتشار خودبخودی به صورت شعاعی در داخل ژل نفوذ کرده و در برخورد با آنتی ژن، حلقه رسوبی قابل رویتی را در ناحیه مشخصی شکل میدهد که اگر ژل شفاف را روی صفحه سیاه رنگی قرار دهیم حلقه شیری رنگ به وضوح قابل تشخیص است اما برای وضوح بیشتر می توان رنگ آمیزی نیز انجام داد. قطر دایره رسوبی اندازه گیری می شود و مساحت دایره رسوبی مستقیماً با غلظت آنتی بادی در نمونه سرم ارتباط دارد.

با استفاده هم زمان از آنتی بادی با غلظت معلوم (به موازات تست اصلی) می توان غلظت نمونه مجهول را در مقایسه با نمونه های معلوم با دقت بالا تعیین نمود.

2 - جستجو و عیارسنجی آنتی ژن : خواسته محقق در این حالت جستجو و تعیین مقدار آنتی ژن در نمونه مجهول است. برای تعیین عیار از مقایسه با آنتی ژن دارای غلظت مشخص استفاده می شود. و به کار بردن آنتی بادی معلوم برای پی بردن به حضور آنتی ژن الزامی است. آنتی بادی معلوم همان سرم حاوی آنتی بادی پلی کلونال اختصاصی آنتی ژن است و معمولاً غلظت آن از قبل مشخص است.
آنتی بادی معلوم در داخل ژل پخش می شود (قبل از انجماد ژل) و این بار آنتی ژن مجهول (و به طور هم زمان آنتی ژن های با غلظت معلوم) به داخل چاهک ها اضافه می شوند انتشار شعاعی آنتی ژن، در فاصله مشخصی از مرکز دایره، منجر به واکنش ایمنی شده و رسوب قابل رویت کمپلکس های ایمنی ایجاد می شود.  مقایسه مساحت دایره رسوبی حاصل از نمونه مجهول در مقایسه با مساحت دایره رسوبی حاصل از رقت های مختلف آنتی ژن معلوم، ما را قادر می سازد که محتوی آنتی ژنی نمونه مجهول را با دقت قابل قبولی بدست آوریم.

مواد لازم

آگارز با دمای انجماد مناسب
سدیم آزاید   Na3N
بافر فسفات  با pH=7.2
رنگ کوماسی بلو
متانول
اسید استیک گلاسیال
آب مقطر
لام شیشه ای یا پلیت مناسب (Slide or Plate)
آنتی ژن معلوم (برای جستجوی آنتی بادی)
آنتی بادی معلوم (برای جستجوی آنتی ژن)
بن ماری
پانچ
سمپلر
نوک سمپلر
پی پت
شعله گاز (چراغ بنسن)
 

روش کار:

نکته : غلظت ژل می تواند بر حسب نیاز تنظیم شود (نیم تا 3 درصد). اگر غلظت ژل به 7 درصد برسد انتشار نمونه متوقف شده و نتایج به صورت کاذب منفی خواهد شد.
نکته : هنگام ذوب نمودن ژل، مقداری از آب ژل تبخیر می شود و لذا باید به حجم نهایی ژل توجه نمود و با مسدود نمودن ظرف از تبخیر ناخواسته جلوگیری نمود.
نکته : سدیم آزاید باید به غلظت نهائی 0/1 درصد برسد.
نکته : دمای بالاتر از 80 درجه برای ذوب اولیه ژل لازم است در صورتی که ژل کاملاً ذوب شود شفاف می شود اما اضافه کردن آنتی ژن یا آنتی بادی به ژل، در دمای پایین (کمی بالاتر از دمای انجماد ژل) صورت می گیرد.

طرز تهیه ژل:

برای درست کردن ژل آگارز با غلظت 1/5 درصد به حجم نهائی 10 سی سی به ترتیب زیر اقدام کنید.

آگارز                      150 میلی گرم
سدیم آزاید               10 میلی گرم
بافر فسفات             10 سی سی

آگارز و سدیم آزاید را وزن نموده و به لوله حاوی 10 سی سی بافر اضافه کنید. لوله را در حالی که "در" آن را با "پنبه پیچیده شده در ورق آلومینیمی"  مسدود نموده اید در بن ماری قرار دهید تا گرم شده و به نقطه ذوب کامل برسد. پس از ذوب کامل و شفاف شدن محلول ژل، می توان آن را در یخچال 4 درجه به طور سربسته (برای جلوگیری از تبخیر آب و تغلیظ ناخواسته ژل) نگهداری نمود موقع مصرف، مجدداً آن را در بن ماری ذوب نموده و قبل از اضافه کردن آنتی ژن یا آنتی بادی دما را به 43 درجه برسانید.

آماده نمودن اسلاید (یا پلیت) :
پلیت ها یا اسلاید هایی که می خواهید ژل را روی آن پخش کنید باید از قبل آماده سازی شوند تا ژل محکم به بستر بچسبد مخصوصاً اگر می خواهید که آن را خشک نموده و بعد آن را رنگ کرده و طولانی مدت نگهداری کنید. برای این کار، سطح مورد نظر را با آگارز 1/5 درصد ( در بافر فوق) بپوشانید و اجازه دهید کاملا خشک و سفت شود.
اضافه کردن آنتی ژن به ژل :
در روش ایمونودیفوزیون شعاعی منفرد یکی از دو ماده آنتی ژن یا آنتی بادی قبل از انجماد ژل با آن مخلوط می شود.
برای اضافه کردن آنتی ژن یا آنتی بادی به ژل، ابتدا لوله محتوی محلول 1/5 درصد آگارز را که از قبل آماده نموده اید به دمای مناسب برسانید (دمایی که ژل در آن دما هنوز منجمد نشده و مخلوط کردن آنتی ژن یا آنتی بادی نیز باعث تخریب آنها نمی شود) از محلول غلیظ آنتی ژن به روی ژل آنقدر اضافه نموده و مخلوط کنید تا غلظت مورد نظر آنتی ژن در ژل حاصل شود.

نکته : اگر محلول آنتی ژن (یا آنتی بادی) غلیظ باشد حجم اضافه شده در این مرحله بسیار کم است و غلظت ژل تحت تاثیر قرار نمی گیرد اما اگر غلظت آنتی ژن (یا آنتی بادی) کمتر باشد حجم زیادی از آن لازم است در این صورت بهتر است حجم بافری که به ژل اضافه می شود به اندازه ای کم شود که پس از افزودن آنتی ژن  به حجم نهایی پیش بینی شده نزدیک گردد.

نکته : آنتی ژن (یا آنتی بادی) باید در همان بافری رقیق شده باشد که برای درست کردن ژل استفاده شده است.

پخش ژل روی اسلاید یا پلیت:

ژل حاوی آنتی ژن را که گرم و مایع است کاملا مخلوط نموده و با استفاده از پی پت گرم یا لوله ای که در آن مخلوط کرده اید روی پلیت یا اسلایدی که از قبل آماده نموده اید سریعا پخش کنید به طوری که لایه ای به ضخامت 2 میلی متر در سطح آن تشکیل شود. (3 سی سی ژل برای مساحت 30 در 50 میلیمتر) دقت کنید تا موقع پخش ژل، در آن حباب هوا ایجاد نشود و حباب های سطحی را نیز باید برطرف کرد. به مدت 15 دقیقه نگهداری کنید تا ژل سرد شده و منجمد شود.

با استفاده از پانچ مخصوص حفره هایی به قطر 3 میلی متر در ژل ایجاد کنید بطوری که فاصله مرکز حفره ها از همدیگر و از حاشیه پلیت نباید کمتر از 1 سانتی متر باشد.

نگهداری پلیت ها:

پلیت های تهیه شده می توانند پس از قرار گرفتن در محفظه کاملا سربسته به مدت چندین هفته نگهداری شوند.

مرحله اصلی آزمایش:

نکته : برای هر رقت دو تا تست در نظر گرفته می شود. انتخاب رقت ها برای حفره ها باید طوری باشد که دو رقت مساوی در دو خانه مجاور هم قرار نگیرند. برای هر تست سرم کنترل مثبت و منفی به صورت دوپلیکه باید در نظر گرفته شود حتی لازم است رقت های مختلفی از سرم کنترل ها در نظر گرفته شوند تا تعیین تیتر سرم مجهول با دقت بیشتری انجام گیرد.

برای هر حفره حدود 10 میکرولیتر از سرم (یا رقیق شده) منتقل می شود سپس 24 ساعت در فضای مناسب نگهداری می شود تا واکنش بین آنتی ژن و آنتی بادی انجام شود اگر پلیت را در روی یک صفحه سیاه قرار دهید یک یا چند دایره شیری رنگ (کدر) مشاهده خواهد شد که نمایانگر وجود خط رسوبی مربوط به کمپلکس های آنتی ژن با آنتی بادی میباشد.

رنگ کردن ژل (1) :

هدف: برای وضوح بیشتر می توان ژل را رنگ کرد.
مراحل رنگ آمیزی :

حذف مواد ناخواسته : وقتی آنتی بادی با آنتی ژن اختصاصی خود در داخل ژل واکنش می دهد کمپلکس های تشکیل شده بنا به دلایل زیر نامحلول بوده و رسوب می کنند:
1 - آنتی ژن از اپی توپ های متنوع تشکیل شده است.
2 - آنتی بادی دارای دو بازوی اتصال به آنتی ژن است.
3 - آنتی بادی های مورد استفاده پلی کلونال هستند.
بدین معنی که از نظر تئوری به تعداد اپی توپ های موجود در سطح آنتی ژن تعداد زیادی آنتی بادی می تواند به آن وصل شوند لذا شبکه پیچیده ای از مولکول های آنتی ژن و آنتی بادی ایجاد می شود که به صورت رسوب شیری رنگ در نهایت قابل رویت می شود.
اما پروتئین های دیگر موجود در سرم و آنتی ژن اولاً محلول هستند دوماً می توانند در رنگ آمیزی شرکت کنند بنابر این برای اینکه فقط رسوب کمپلکس ایمنی رنگ شود باید پروتئین های دیگر را قبل از رنگ آمیزی حذف نمود برای اینکار از خصوصیت محلول بودن این پروتئین ها استقاده نموده و با نگهداری 24 ساعته ژل در داخل بافر، آنها را از ژل خارج نموده و دور می ریزیم بدین منظور ابتدا پلیت را از بافر فسفات پر می کنید و در عرض 24 ساعت دو بار بافر را عوض کرده و بافر جدید اضافه می کنید بدین وسیله تمام ترکیبات ناخواسته سرم حذف می شوند.

رنگ آمیزی (1) : پلیت را از رنگ (1) کوماسی بلو (Coomassie Brilliant Blue R-250) پر کرده و 2 تا 3 ساعت نگهداری کنید. طرز تهیه رنگ در انتهای صفحه آمده است.
رنگبری : برای حذف رنگ هایی که به پروتئین ها متصل نشده اند پس از خالی کرده رنگ کوماسی، داخل پلیت را با آب مقطر پر کنید و آنقدر کار شستن را تکرار کنید تا هیچ رنگی در زمینه پلیت باقی نماند.
اندازه گیری : قطر دایره رسوبی را با خط کش مخصوص اندازه گیری کنید. و مساحت دایره را از طریق فرمول یا جدول بدست آورید.

اگر قرار است که ژل رنگ شده زمان بیشتری نگهداری شود بهتر است از روش رنگ آمیزی زیر که شامل یک مرحله آبگیری از ژل هست استفاده شود.

رنگ آمیزی ژل (2) :

هدف : نگهداری دراز مدت ژل رنگ شده:

آبگیری : پس از مرحله حذف ترکیبات ناخواسته از ژل یک تکه کاغذ صافی مرطوب را روی ژل قرار دهید بر روی آن چهار حلقه کاغذهای جاذب (مثلاً دستمال کاغذی) را قرار دهید و بر روی آنها نیز یک پوشش شیشه ای قرار داده و وزنه ای را روی آن قرار دهید اندازه وزنه 10 گرم بر سانتی متر مربع انتخاب شود. به مدت 15 دقیقه صبر کرده و بعد کاغذهای جاذب را با کاغذهای جدید جایگزین کنید و دوباره تحت فشار وزنه قرار دهید سپس کاغذهای جاذب را برداشته و در حالی که کاغذ فیلتر هنوز بر روی ژل باقی است تحت حرارت هوای گرم قرار دهید تا  خشک شود. وقتی ژل کاملاً خشک شد کاغذ فیلتر را نیز از روی آن برداشته و رنگ آمیزی کنید با روش زیر:

سطح ژل را با رنگ (2) بپوشانید 5 تا 10 دقیق صبر کنید سپس از محلول متانول اسید استیک برای رنگبری استفاده کنید تا رنگ زمینه کاملاً حذف شود (چندین بار و هر بار 30 دقیقه) سپس ژل را در دمای اتاق قرار دهید تا کاملا خشک شود و بعد اندازه گیری قطر دایره های رسوبی را شروع کنید. با استفاده از فرمول یا جدول، قطر دایره رسوبی را به مساحت تبدیل کرده و مقایسه کنید.

اگر شرایط کاری (مواد به کار رفته، حجم ها، روش کار و کنترل ها) ثابت نگهداشته شود نتایج تکرار پذیر خواهد بود و مقایسه نتایج چندین تست کاملا امکان پذیر خواهد بود. در هر حال اختلاف یک سوم (1/3) در مساحت دایره رسوبی به عنوان  اختلاف معنی دار در غلظت آنتی بادی تلقی خواهد شد.

نکته : برای تهیه رقت های آنتی بادی به توصیه های کارخانه سازنده آن دقت کنید.

طرز تهیه رنگ برای رنگ آمیزی ژل (1)

طرز تهیه رنگ برای رنگ آمیزی ژل (2)

خط کش مخصوص اندازه گیری قطر دایره

فرمول محاسبه مساحت دایره

جدول آماده برای تعیین مساحت دایره
 

در حفره ها مخلوط ویروس و دترژانت را که برای خرد کردن ویروس اضافه کرده اید میریزید و آنتی ژن غالب در این روش هماگلوتینین است که دایره رسوبی بزرگتری ایجاد میکند. به صورت هم زمان رقت های مختلف آنتی ژن استاندارد نیز به کار برده می شود (مثلاً 2، 4، 6، 8، 10، 12، 14، 16، 18، 20 میکرولیتر در هر سی سی) با استفاده از این رقت ها منحنی استاندارد رسم شده و غلظت آنتی ژن مجهول از روی آن استخراج می شود.

2) دترژانت : سدیم لوریل سارکوزینات(Sodium Lauryl Sarcosinate, Sarkosyl NL-97, Geigy) : به مقدار 500 میلی گرم در 10 میلی لیتر بافر فوق حل می نماییم و در دمای اتاق نکهداری می کنیم.

ویروس باید از نوعی انتخاب شود که دارای آنتی ژن های نوعی (Type)  باشد اما آنتی ژن های سطحی (NA, HA) شایع در گونه هایی که سرم از آنها تهیه شده است را نداشته باشد. مثلا برای سرم انسانی از ویروس انفلوانزای حیوانی نظیر نوع اسبی و مرغی استفاده می شود مثل H7N7

ویروس تخلیص شده را در بافر ذکر شده رقیق می کنیم طوری که غلظت 0.5 mg/ml  پروتئین حاصل شود. از محلول 5 درصد دترژانت (سارکوزینات) استفاده نموده و بر روی 4 میلی لیتر از سوسپانسیون ویروسی به اندازه ای اضافه میکنیم که غلظت 1 درصد دترژانت حاصل شود (میشه 1 سی سی) به دمای 37 درجه رسانده و 10 دقیقه انکوبه می کنیم تا ویروس حل شود. اگر قبلا به مدت یک دقیقه در دمای 100 درجه نگهداری کنیم تا نوکلئوپروتئین غیر فعال شود این تست می تواند اختصاصاً برای اندازه گیری پروتئین M به کار رود.

  دفتر ترجمه ، تاليف و نشر استيار

s_rasoul@yahoo.com
 

 

پست الكترونيك ما :

s_rasoul@yahoo.com

 

پست الكترونيك ما :

soleymanirasool@gmail.com

شماره تماس :

09362976920

سايت اينترنتي :

http://www.soleimani.us